第150期? 尺寸排阻色譜法填料的選擇

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一、什么是尺寸排阻色譜

利用填料的細(xì)孔，根據(jù)分析樣品中各分子大小的差異進(jìn)行洗脫的分離模式。取Size Exclusion Chromatography 開頭字母，簡(jiǎn)寫為SEC。由于填料與分析樣品之間不發(fā)生相互作用（如吸附）， 因此，這是一種分析樣品變性發(fā)生可能性較低的分離模式。此外，該模式只使用單一流動(dòng)相，相對(duì)簡(jiǎn)單的設(shè)備就能進(jìn)行穩(wěn)定的分析，且當(dāng)知道有關(guān)分子量（大?。┑男畔r(shí)，還可以預(yù)測(cè)洗脫位置。另外，還有可以在保持聚體不解離的情況下即可對(duì)其進(jìn)行分離的一大特長(zhǎng)。 分離模式圖如圖1-1 所示。色譜柱中充填了具有幾十到幾百納米細(xì)孔的填料。分子通過色譜柱時(shí)，尺寸較小的分子滲透至填料的細(xì)孔內(nèi)部，像繞行一樣繞過色譜柱內(nèi)部流過。另一方面，尺寸較大的分子由于無法滲透至細(xì)孔內(nèi)部，從填料外側(cè)流過。結(jié)果，分子尺寸較大的分子較早洗脫，較小的分子較晚洗脫。

圖1-1 尺寸排阻色譜法的分離示意圖

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? ? 圖1-2 是色譜柱內(nèi)示意圖和分子量計(jì)算用校正曲線示例。校正曲線是通過測(cè)定已知分子量的分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以各自的分子量對(duì)數(shù)與洗脫體積（或洗脫時(shí)間）繪制而來。比填料細(xì)孔直徑大的分子無法滲透到填料內(nèi)部，因此，它們由填料外部體積部分流出，并從色譜柱中洗脫出來（這稱為空隙體積或排阻極限洗脫體積V_O）。無論什么分子，在理論上，其洗脫速度不會(huì)比V_O 快。另一方面，比細(xì)孔小的分子則根據(jù)尺寸滲透到細(xì)孔內(nèi)部。流動(dòng)相總體積V_M是流經(jīng)填料外部的體積（V_O）和填料內(nèi)的細(xì)孔內(nèi)體積（V_i）之和（= 流動(dòng)相體積，V_M= V_O + V_i）。因此，在理論上，沒有洗脫遲于V_M 的分子。該體積稱為總滲透極限洗脫體積。所有分子均在排阻極限洗脫體積（V_O）和總滲透極限洗脫體積（V_M）之間洗脫，從分子尺寸較大的開始，依次進(jìn)行洗脫。

圖1-2 尺寸排阻色譜用色譜柱的示意圖和校正曲線

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二、填料選擇

1. 基質(zhì)種類

尺寸排阻色譜主要有兩種填料，一種是以硅膠作為基質(zhì)的硅膠類填料，另一種是以多孔聚合物為基質(zhì)的聚合物類填料。由于蛋白的單個(gè)分子量通常在1萬到數(shù)十萬Da之間，分離時(shí)，一般使用在特定分子量區(qū)間中校正曲線斜率較緩的硅膠類填料的色譜柱。硅膠類填料機(jī)械強(qiáng)度高，耐壓性好，而且，還有小粒徑填料裝填的高分辨率色譜柱可選用。圖1-3是標(biāo)準(zhǔn)蛋白硅膠類填料的校正曲線，圖1-5是標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離色譜圖。

? ? 另一方面，與硅膠類填料相比，聚合物類填料色譜柱的校正曲線的坡度較陡，但分子量分離范圍較寬，校正曲線的線性也很好，因此，適用于核酸等具有分子量分布的分析樣品的分離。另外，還有大孔徑的色譜柱，可適用于病毒和DNA等巨型生物大分子的分離。同時(shí)還具有耐堿性，可在較大的pH值范圍內(nèi)使用，可以使用堿溶液進(jìn)行清洗。圖1-4是標(biāo)準(zhǔn)蛋白聚合物類填料的校正曲線，圖1-6是標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離色譜圖。

圖1-3 校正曲線（硅膠基質(zhì)填料）??? ?????????圖1-4 校正曲線（聚合物基質(zhì)填料）

圖1-5標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離實(shí)例（硅膠基質(zhì)填料）圖1-6 標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離實(shí)例（聚合物基質(zhì)填料）

2. 基質(zhì)的種類和特點(diǎn)

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3. 孔 徑

孔徑?jīng)Q定可以分離的分子尺寸，因此，選擇適合所測(cè)分子孔徑的色譜柱是必要的。具體而言，應(yīng)選擇所測(cè)分子在校正曲線較為平緩的范圍內(nèi)洗脫的色譜柱。測(cè)定分子量分布較寬的分子時(shí)，可將填料孔徑不同的色譜柱串聯(lián)。

4. 粒 徑

粒徑越小，理論塔板數(shù)越高，分辨率就高。另一方面，壓力損失與粒徑的平方呈反比，粒徑越小時(shí)，色譜柱壓力越高。因此，選擇時(shí)需要同時(shí)考慮所使用的儀器的耐壓性能。使用不同粒徑的色譜柱分離標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖1-7所示。可以看出，粒徑為5 μm 的 TSKgel G3000SWXL與粒徑為 2 μm 的 TSKgel UP-SW3000 相比，后者峰形更尖銳，理論塔板數(shù)也更高，即分辨率更高。

圖1-7 粒徑對(duì)分離的影響